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Optimisation moléculaire de vaccin contre le paludisme associé à la grossesse

La protéine PfEMP1 codée par var2csa est impliquée dans l’adhérence des hématies parasitées (HP) au chondroïtine sulfate A (CSA) placentaire. VAR2CSA est constituée de 6 domaines DBL, dont 3 non classifiés. La structure globale de VAR2CSA est conservée, mais les domaines DBL sont variables. Bien que plusieurs domaines de VAR2CSA aient de l’affinité pour le CSA in vitro, il est probable que plusieurs domaines de VAR2CSA contribuent à la formation in vivo d’une cannelure commune. Notre objectif est d’identifier les épitopes capables d’induire une réponse immune cross-réactive protectrice contre divers variants parasitaires. Des constructions de multi-domaines et de la protéine entière sont employées pour vacciner des souris. Leur capacité à induire des anticorps anti-adhérence est déterminée dans plusieurs systèmes d’adhésion.

Nous avons déjà montré que la région Id1-DBL2X (proche de l’extrémité N terminale de VAR2CSA) est capable d’induire la synthèse d’anticorps au pouvoir inhibiteur de l’adhésion similaire à celui obtenu avec la protéine entière. Nous étudions la variabilité de la séquence Id1-DBL2X dans des populations parasitaires de différentes régions géographiques. Des isolats de P. falciparum du Sénégal, Bénin, Tanzanie, Cameroun, Papouasie, Pérou et Thaïlande ont été collectés.  Les ADN ont été extraits puis la région Id1-DBL2X du gène var2csa a été séquencée par technologie 454.  La variabilité est en cours d’analyse bioinformatique. Les résultats permettront de sélectionner les variants les plus pertinents qui signeraient de potentiels biais géographiques dans la distribution globale des variants de VAR2CSA.  Parallèlement, des parasites isolés de femmes enceintes au Bénin sont caractérisés en terme de phénotype d’adhérence à divers récepteurs de l’hôte (CSA, CD36 et ICAM1) et d’expression de VAR2CSA à la surface des HP. Le pouvoir inhibiteur de l’adhérence au CSA des anticorps induits contre les variants 3D7 et FCR3 de VAR2CSA est mesuré sur ces isolats. La région N-terminale incluant Id1-DBL2X de var2csa sera séquencée à partir du cDNA des isolats actuellement en cours de caractérisation et les variants les plus pertinents seront produits sous forme recombinante chez E. coli.  Leur repliement et leur capacité d’interaction avec le CSA seront caractérisés.  Des animaux (souris, rats, lapins) seront immunisés avec ces protéines recombinantes associées à l’adjuvant complet de Freund, à l’alun ou sans adjuvant.  Les IgG seront purifiées du plasma de ces animaux afin d’évaluer leur capacité à reconnaître la protéine native et à inhiber la liaison au CSA. Le but ultime est de définir l’antigène optimal ou une combinaison de variants ainsi que la formulation qui permet l’induction d’anticorps anti-adhérence avec un large spectre d’activité sur les parasites isolés de femmes enceintes. Nous sélectionnerons les antigènes de VAR2CSA les plus prometteurs et produirons des protéines de qualité GMP pour les études de toxicologie chez l’animal. Nous coordonnerons l’essai clinique de phase Ia en France et Ib au Bénin.  En parallèle, nous réaliserons une étude d’acceptabilité d’un vaccin contre le paludisme de la grossesse au Bénin, et préparerons un protocole pour une étude de phase II.

Identification des protéines parasitaires exprimées à la surface des hématies dans le paludisme

La virulence du parasite est liée à sa capacité à exprimer des antigènes variables de surface (VSA). Ces derniers présentent une affinité pour différents récepteurs de l’hôte, impliqués dans la physiopathologie des formes graves (paludisme gestationnel et cérébral). Lors de sa maturation, le parasite met en place un trafic protéique conséquent au niveau membranaire et sub-membranaire de l’HP qui donne lieu à la formation de knobs permettant l’expression des VSA dont PfEMP1. Ces PfEMP1 sont minoritaires, noyées dans une masse protéique érythrocytaire présentant un haut degré d’insolubilité.

Nous disposons de données d’une étude protéomique nano LC MS/MS portant sur des isolats d’accès gestationnel ou cérébral. Ces données sont en cours d’analyse par des méthodes ACP, clustering supervisé ou non, ou genepattern qui devrait faire émerger des protéines ou des fonctions biologiques préférentiellement associées à une forme clinique. Les données protéomiques seront mises en relation avec les données transcriptomiques obtenues précédemment. Les PfEMP1 de ces isolats seront identifiées en nano LC MS/MS et comparées. L’étude en rt-qpcr de ces mêmes isolats ciblant la famille des gènes var permettra d’identifier des peptides ou régions de domaines DBL discriminants pour chaque forme clinique.

Les protéines singulières des formes cérébrales et gestationnelles seront caractérisées du point de vue fonctionnel et immunogène ; des études de liaison seront développées via une puce à protéine. A plus long terme, une approche protéomique quantitative avec des peptides de synthèse sera développée en complément de cette étude qualitative.

Influence du portage de l’HbS sur l’immunité à P. falciparum.

L’infection à P. falciparum reste associée à une forte mortalité chez les jeunes enfants en zone d’endémie. Au cours du développement érythrocytaire le parasite exporte ses propres protéines dans le cytosol et à la membrane des hématies, modifiant leurs compositions et propriétés mécaniques, et permettant la croissance du parasite. Celle-ci se trouve compromise chez les individus porteurs de facteurs génétiques tels que l’hémoglobine anormale HbS, dont la fréquence à l’état hétérozygote est élevée en Afrique. Les mécanismes de protection contre la pathologie palustre conférés par ce portage du trait drépanocytaire ne sont pas complètement élucidés. La phosphorylation, qui est un mécanisme important de régulation des interactions protéiques dans la membrane des hématies, est altérée dans les GR HbS. Une phosphorylation accrue de la chaîne  de la spectrine par la caséine kinase I membranaire perturbe la stabilité mécanique des membranes érythrocytaires, et la phosphorylation de l’ankyrine module considérablement les interactions au sein du complexe spectrine – ankyrine – bande 3. Par ailleurs, de récents travaux relatent une interaction entre les voies humaines et parasitaires de phosphorylation dans les GR infectés par P. falciparum.

Le projet consistera à étudier l’impact d’une phosphorylation altérée de composants du cytosquelette d’origine érythrocytaire (spectrine, ankyrine et bande 3) ou de P. falciparum sur la présentation membranaire de phospho-antigènes parasitaires dans les GR anormaux infectés. Une première étude, concernant les trois protéines sélectionnées du cytosquelette et la protéine RESA de P. falciparum, consistera à caractériser par spectrométrie de masse leurs états de phosphorylation dans des GR normaux infectés par P. falciparum in vitro. Les protéines kinases humaines et/ou parasitaires impliquées dans les interactions cytosquelette/protéine RESA seront identifiées au sein de ce même type de GR. L’altération des phosphorylations sera ensuite évaluée dans des GR HbAS et HbSS infectés in vitro par P. falciparum. L’étude sera ensuite élargie à d’autres phospho-antigènes parasitaires identifiés comme interagissant avec les éléments du cytosquelette érythrocytaire, tel l’antigène PfEMP1. 

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